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 Ambiente
Api, mais e neonicotinoidi (parte I)
 
di Mario Colombo*, Marta Mazzoleni** e Paolo Tremolada**, Francesco Saliu*** e Marco Vighi***
 
Assodato il pericolo neonicotinoidi, la cosa che più mi meraviglia è che nulla si dica delle morti di apiari, conseguentemente ai trattamenti effettuati sugli individui adulti di Diabrotica del mais e sulle larve di Piralide, nel periodo di piena fioritura del mais. Più precisamente, parrebbe che nei mesi di giugno, luglio e agosto, periodo in cui si fanno questi interventi, non ci siano mortalità o fortissimi indebolimenti delle famiglie di api. Veramente molto strano, considerando che una stima per difetto delle superfici trattate è di 80.000/100.000 ettari, pari a ottocento/mille milioni di metri quadrati; mentre fra i prodotti più impiegati, risulta una miscela di due insetticidi ad ampio spettro d’azione. Eppure, davanti a questa grave situazione, a grande impatto ambientale, non risultano ufficialmente mortalità di alveari. Ricorrente è la voce di morte di fauna selvatica, per esempio di fagiani, ma i dati ufficiali dicono che le api non subiscono danni. Fantastico! Eppure, se si esce dalle stanze dove entra solo l’ufficialità e si parla con gli apicoltori, si viene a sapere che le api sono morte, gli alveari si sono indeboliti e l’imminente inverno verrà affrontato da questi apiari, flagellati dai pesticidi, con grande precarietà o rischio di estinzione
 
Introduzione
Eventi di moria diffusa di api si verificano ormai da diversi anni in molte parti del mondo (vanEngelsdorp et al., 2007; Laszlo, 2008). Negli Stati Uniti è stata coniata l’espressione Colony Collapse Disorder (CCD) per far riferimento ad una sindrome, non ancora completamente chiarita, che porta al collasso della colonia con perdita completa della famiglia (Hileman, 2007; Johnson et al., 2009a). In Italia è stato avviato un progetto molto articolato (progetto Apenet) che ha principalmente lo scopo di evidenziare lo stato di salute delle api in Italia e chiarire, per quanto possibile, il ruolo delle diverse cause che determinano questi fenomeni (Bortolotti et al., 2009).
Le attuali ipotesi sulle motivazioni delle morie prendono in considerazione diversi fattori che possono agire singolarmente o in sinergia tra loro. Tra questi ci sono i fattori parassitari come la recrudescenza della varroa o patologie nuove o emergenti come Nosema ceranae (Higes et al., 2009) o il virus israeliano della paralisi acuta delle api (IAPV) (Ribiere et al., 2008), fattori legati all’uso dei fitofarmaci sia quelli usati per la protezione delle colture, sia quelli impiegati nel controllo dei parassiti dell’alveare (Decourtye et al., 2004; Johnson et al., 2009b). A questi si aggiungono eventuali fattori ambientali di stress come la carenza ed il basso valore nutrizionale di polline e nettare dovuto al tipo di gestione del territorio e agli andamenti climatici anomali (Le Conte and Navajas, 2008) e, da ultimo, fattori legati alle pratiche apistiche scorrette o logoranti.
Vari Autori evidenziano come tutti questi fattori possano essere causa principale o secondaria, determinando la moria, o predisponendo la colonia ad essa. In particolare, il ruolo dei diversi farmaci e simili, impiegati sia direttamente nella colonia o altri presenti nel contesto ambientale ispezionato dalle api, è alquanto complesso. Basti pensare ai trattamenti anti-varroa, attuati all’interno dell’alveare, che colpiscono l’acaro ma lasciano indenne l’ape. L’impiego di integratori alimentari e di biostimolanti che vanno a complicare il quadro alimentare e di prodotti con cui l’ape viene a contatto. Ma anche all’esterno dell’alveare le api devono confrontarsi con sostanze che possono minare la salute dell’intera famiglia. E’ il caso dei fitofarmaci che, in maniera differente e con molecole appartenenti a gruppi chimici estremamente diversificati, sono in grado di essere più o meno nocive alla colonia. (Villa et al., 2000). Il problema va quindi visto nella sua complessità e considerando sia gli effetti diretti di mortalità che gli effetti sub-letali, quali quelli legati al comportamento e al successo riproduttivo (El Hassani et al., 2008).
Tra i fitofarmaci, quelli attualmente più discussi sono i neonicotinoidi usati nella concia delle sementi.
Inizialmente, il rischio associato al loro utilizzo era stato sottovalutato in base al principio secondo il quale i prodotti che prevedono un interramento determinano, a priori, danni trascurabili per le api. In seguito, questo assunto è stato ampiamente contraddetto dall’evidenza della concomitanza temporale di molti degli eventi di moria con le semine del mais e da alcuni casi conclamati, in cui si è dimostrata una dipendenza diretta delle morie da questi insetticidi, come nell’incidente avvenuto nel 2008 nella regione del Baden-Wurttemberg, Alsazia e Baviera in cui si è avuta la moria di 11500 alveari attribuendone la causa ad un errore nelle operazioni di concia del seme di mais (Bortolotti et al., 2009). I fattori di rischio devono sempre essere tenuti in debita considerazione anche prevedendo la concomitanza di più eventi sfavorevoli. Il sospetto di un possibile ruolo dei neonicotinoidi usati nella concia delle sementi nei casi di moria delle api, ha portato diversi Governi europei alla sospensione dell’autorizzazione di uso di questi prodotti, così pure quello italiano il 17 settembre 2008 ha emanato un decreto di sospensione per la campagna maidicola 2009. Altrettanto si è verificato per l’anno 2010.
Sulla pericolosità per le api dei neonicotinoidi ad uso di concianti, ci sono molti riscontri indiretti ma poche evidenze sperimentali dirette. Ciò ha portato ad aspre contestazioni tra la categoria degli apicoltori, sostenitrice della sospensione cautelativa dell’uso dei neonicotinoidi, e le associazioni agricole, sostenitrici invece della necessità del loro utilizzo, sia pure con le dovute precauzioni.
Gli insetticidi neonicotinoidi come l’acetamiprid, l’imidacloprid, il thiacloprid ed il thiamethoxam sono stati utilizzati come concianti delle sementi, in associazione a fungicidi, per proteggere il seme prima e la plantula in germinazione, poi, dall’attacco di insetti fitofagi e altre avversità. Oltre ad avere un effetto protettivo durante la fase di germinazione, grazie alla loro attività sistemica (capacità di essere assorbiti e traslocati all’interno della pianta), hanno anche un’attività protettiva residuale a lungo termine contro quei fitofagi tipici delle fasi avanzate di sviluppo (Sur e Stork, 2003). Da un punto di vista agronomico, si ottiene un duplice effetto con un unico trattamento che è anche molto limitato in termini di dose ad ettaro (si tratta infatti di un applicazione localizzata e non dispersa su tutta la superficie del terreno).
L’aspetto negativo è la possibile esposizione di organismi “non target” come gli insetti impollinatori in due momenti differenti. Il primo avviene durante le operazioni di semina in cui è possibile una dispersione dell’insetticida in quanto il principio attivo riveste il seme in forma di polvere adesa. Per la semina si utilizzano seminatrici di precisione pneumatiche che aspirano i semi tramite un flusso di aria che poi fuoriesce dalla seminatrice portando con sé anche le polveri che il seme in parte rilascia. Quindi, si ha una possibile emissione di polveri contenenti l’insetticida in aria che interessano l’area di semina; queste, poi, tendono a depositarsi sul suolo seminato e sulla vegetazione limitrofa come mostrato da Greatti et al. (2003 e 2006).
Il secondo momento in cui si ha un’esposizione degli impollinatori a questi prodotti è durante la fase di fioritura della coltura in quanto questi prodotti vengono traslocati anche negli organi fiorali, con conseguente presenza di residui nel polline e nel nettare che possono essere bottinati dalle api, determinando una introduzione di questi prodotti nell’alveare (Halm et al., 2006).
I neonicotinoidi, essendo relativamente selettivi nei confronti degli insetti, sono anche molto tossici per le api (Iwasa et al., 2004). Secondo questi Autori, i neonicotinoidi nitro-sostituiti sono i più tossici. La LD50 dell’imidacloprid è di 18 ng/ape, quella del clothianidin è di 22 ng/ape e quella del thiamethoxam è di 30 ng/ape. I neonicotinoidi cyano-sostituiti presentano invece valori di tossicità molto più bassi (la LD50 dell’acetamiprid è pari a 7.1 μg/ape e quella del thiacloprid è di 14.6 μg/ape). Ma questi ultimi prodotti, meno tossici per le api se da soli, in associazione con fungicidi aumentano di molto la loro tossicità (Iwasa et al., 2004) e spesso la concia delle sementi prevede l’associazione di un principio insetticida con un fungicida. Mentre per i nitro-sostituiti l’accentuarsi della tossicità, al sommarsi di principi attivi diversi,  non si verifica. Questa ricerca presenta una prova sperimentale degli effetti sulle api di una semina di mais con semente conciata con due prodotti commerciali che, prima della sospensione, erano di diffuso utilizzo. I due prodotti concianti Cruiser® e Celest xl® (Syngenta-Italia) erano utilizzati insieme per fornire uno spettro completo di protezione alla semente. Cruiser® contiene il neonicotinoide thiamethoxam come principio attivo mentre Celest xl® contiene i fungicidi fludioxonil e metalaxyl-M.

Materiali e metodi
Area sperimentale e prodotti utilizzati nella concia della semente
La prova sperimentale si è svolta presso la Cascina Virolo, a Mulazzano, in provincia di Lodi, dove il 24 giugno 2008, intorno alle ore 11, è stata effettuata una semina di mais di secondo raccolto su una singola area di 7 ettari (Figura 1), utilizzando una seminatrice pneumatica Kinze 3000. La semente utilizzata era rivestita con i concianti Cruiser® e Celest xl®, come riportato sull’etichetta della semente.
I due formulati sono prodotti dalla Syngenta e, secondo le informazioni del produttore (www.syngenta.it), Cruiser® contiene come principio attivo l’insetticida thiamethoxam alla concentrazione di 350 g/L e Celest xl®, contiene i fungicidi fludioxonil e metalaxyl-M, rispettivamente alle concentrazioni di 25 g/L e 10 g/L.
La dose suggerita per la concia della semente di mais è 100 mL di ciascun prodotto per 100 kg di semi (www.syngenta.it).  Per la semina del mais si utilizzano circa 70 000 semi per ettaro corrispondenti a 21 kg di semente (il peso medio di un seme è di 0.3 g). Questa dose determina un utilizzo di prodotto conciante per ettaro corrispondente ad un quantitativo di thiamethoxam pari a 7,35 g, un quantitativo di fludioxonil pari a 0,525 g ed un quantitativo di metalaxyl-M pari a 0,21 g. Il quantitativo complessivo utilizzato per l’intera area di semina è quindi pari a 51,45 g per il thiamethoxam, 3,675 g per il fludioxonil e 1,47 g per il metalaxyl-M.
Prima della semina, nei pressi del campo utilizzato, sono stati posizionati alcuni alveari sperimentali. Questi sono stati collocati in due punti specifici: uno all’interno del giardino della cascina, a circa 200 m dai campi dove si sarebbe svolta la semina, e uno localizzato ai margini. Il primo gruppo è stato chiamato “gruppo di controllo” in quanto gli alveari erano collocati in un luogo relativamente riparato rispetto all’area di semina.
Il giardino della cascina era circondato da una fitta fascia di vegetazione arbustiva e arborea che avrebbe svolto una funzione di barriera-filtro alla diffusione delle polveri rilasciate nelle operazioni di semina.
L’altro gruppo è stato chiamato “gruppo di esposizione” in quanto gli alveari risultavano in una posizione corrispondente alla massima esposizione possibile. Prima dell’inizio della sperimentazione, entrambi i gruppi di alveari sono stati regolarmente visitati per controllare le condizioni di salute delle famiglie. All’inizio della sperimentazione (due giorni prima della semina), è stata fatta una cernita tra gli alveari disponibili in modo da selezionare quelli che presentassero le stesse condizioni in termini di forza delle rispettive famiglie. La forza della famiglia è stata determinata con il metodo dei sesti e gli alveari selezionati all’inizio della sperimentazione sono risultati 4 nel gruppo di controllo e  2 in quello di esposizione.

Parametri di salute delle api
I due parametri scelti per monitorare lo stato di salute delle api sono stati la mortalità nei pressi dell’alveare mediante la conta delle api morte, rilevate in trappole poste in prossimità dell’entrata dell’alveare, ed il numero di bottinatrici in entrata nell’arnia con carico di polline. Il primo parametro è stato rilevato tramite le trappole underbasket che consistono in vassoi di legno delle dimensioni di 50x100x10 cm, chiusi alla base da una rete molto fitta in grado di trattenere le api cadute e in alto da una rete a maglie più larghe per fare passare le api morte, ma impedire l’ingresso di animali più grossi in grado di portare via le api morte e quindi alterare il dato di mortalità rilevato.
Il secondo parametro, quello del numero delle bottinatrici in entrata nell’alveare, è stato rilevato mediante una conta del numero di api con polline entranti in ogni alveare nell’intervallo di un minuto. Per ogni alveare e ogni giorno, la conta è stata ripetuta tre volte ad intervalli ravvicinati in modo da poter calcolare un dato medio. La registrazione dei dati relativi ai due parametri (api morte e numero di bottinatrici) é cominciata due giorni prima della semina ed è andata avanti giornalmente fino al 28 giugno (4 giorni dopo la semina). Per quanto riguarda il numero di bottinatrici sono stati eseguiti altri due rilievi il 3 ed il 9 luglio corrispondenti a 9 e 15 giorni dopo la semina. Il parametro relativo al numero di api morte è stato rilevato intorno alle ore 16.00 di ogni giorno e si riferisce alle api morte nelle 24 ore precedenti. Il parametro relativo al numero delle bottinatrici è una misura puntuale riferita al momento del rilievo che è stato svolto intorno alle ore 11.00 di ciascun giorno prestabilito.

Raccolta di campioni di vegetazione e analisi chimiche
Il giorno della semina, prima che questa avvenisse, fino a cinque giorni dopo, sono stati raccolti campioni di vegetazione da 12 punti di monitoraggio  (Figura 1): 5 punti ai margini dell’area seminata, 4 punti a 50 m di distanza e 3 punti a 100 m di distanza. Ciascun campione, consistente in circa 100 g di vegetazione erbacea (soprattutto graminacee), dopo la raccolta è stato posto in buste di plastica e congelato a -20 °C. Al momento della fioritura del mais nato dalla stessa semina è stato raccolto anche un campione di polline. Le analisi chimiche per la quantificazione degli eventuali residui di thiamethoxam sono state condotte nei laboratori del Dipartimento di Scienze dell’Ambiente e del Territorio dell’Università di Milano-Bicocca ed hanno previsto una fase di estrazione con una soluzione di metanolo e acqua (3:1), poi una filtrazione dell’estratto ed una purificazione prima con una colonna cromatografica di terre di diatomee, infine con una colonna cromatografica di silice.
L’estratto purificato è stato concentrato a piccolo volume ed analizzato mediante spettrometria di massa (MS) abbinata alla cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). La procedura analitica è stata testata mediante prove di recupero utilizzando un’aggiunta di thiamethoxam pari a 1,0 e a 0,2 μg/g. Il recupero analitico dell’insetticida è risultato tra il 78 ed il 104% con una precisione tra il 2 e il 16%. Il limite di rilevabilità analitica del metodo è risultato essere pari a 50 ng di thiamethoxam per g di peso fresco di vegetazione.
I dettagli relativi al metodo analitico utilizzato sono reperibili presso gli Autori.

Analisi statistica
Per l’analisi statistica sono stati usati i seguenti test parametrici: test t di Student, ANOVA e Modello Lineare Generalizzato (GLM) con il test post-hoc di Duncan. La normalità dei dati è stata verificata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov. Tutti i test statistici sono stati effettuati con software SPSS ver. 17.0.

Risultati
Il numero di api morte e quello delle bottinatrici in entrata nell’alveare in relazione alle operazioni di semina di mais, sono riportati nelle Tabella 1 e 2.
Nel giorno della semina (24 giugno) si ha un aumento del numero di api morte negli alveari di esposizione, mentre negli stessi alveari il numero delle bottinatrici sembra diminuire solo il giorno successivo in quanto il rilevamento di quest’ultimo parametro è stato fatto alle 11 del mattino, prima della semina del mais. L’andamento medio dei due parametri negli alveari di controllo e in quelli di esposizione sono evidenziati nei grafici delle Figure 2 e 3.
Nella Figura 2 si osserva che il numero di individui morti negli alveari posti in vicinanza del campo presenta un picco di mortalità nel giorno della semina per poi scendere a valori più bassi nei giorni successivi. Negli alveari di controllo si nota invece un’oscillazione dei valori non in relazione con le operazioni di semina. L’analisi della varianza (ANOVA) sui dati di mortalità rilevati nelle “underbasket” per gli alveari di esposizione mostra che il numero di individui morti negli alveari in campo varia significativamente in funzione del tempo (p=0,004); utilizzando poi il test di Duncan si mette in evidenza come il giorno della semina abbia una mortalità significativamente superiore agli altri giorni. Il picco di mortalità nel giorno della semina è evidente, ma riguarda un numero limitato di individui, infatti il numero totale di api morte per giorno e per alveare passa da circa 20 a 45 in concomitanza della semina. L’aumento è considerevole ma il numero assoluto di api morte rinvenute nelle underbasket è molto limitato in confronto alla consistenza della colonia (50 000 api) in termini percentuali riguarda una proporzione minima (aumento della mortalità del 0,05%). Questo non esclude che un numero più consistente di api possa essere morto altrove, ma tale evento non viene rilevato dal dato della mortalità nelle “underbasket”. Il numero di bottinatrici con polline che entrano nell’alveare in un minuto ha, invece, un significato concettuale differente.
Un’eventuale flessione di questo parametro ha una valenza molto maggiore sull’alveare in quanto interessa un numero di api molto più grande. Infatti, questo parametro ha già il significato di una proporzione sul totale delle bottinatrici (frequenza di entrata delle bottinatrici con polline e non di un numero assoluto). La flessione del numero di bottinatrici, il giorno successivo alla semina, appare evidente soprattutto negli alveari di esposizione (Figura 3) rispetto a quelli posti all’interno del nucleo aziendale (alveari di controllo).
Anche l’analisi statistica ha evidenziato differenze significative (p < 0,05) tra i due gruppi sperimentali dal 25 giugno (giorno successivo alla semina) fino al 28 giugno (4 giorni dopo la semina), anche se il numero medio delle bottinatrici diminuisce per entrambi i gruppi di alveari a partire dal giorno successivo alla semina (25 giugno). Infatti, l’effetto del giorno della semina del mais sul numero di bottinatrici è rilevabile anche per gli alveari di controllo. L’analisi statistica effettuata con il modello lineare generalizzato (GLM) evidenzia che sia la posizione degli alveari, sia il fattore data hanno un effetto significativo sul numero di bottinatrici in entrata nell’alveare (p<0,001). Come già ricordato sopra, il fatto di non riscontrare una diminuzione delle bottinatrici il giorno stesso della semina dipende dal fatto che la raccolta dei dati di questo parametro avviene intorno alle ore 11.00 di ogni giorno e, pertanto, nel giorno della semina il rilevo risulta concomitante con l’inizio delle operazioni di semina e quindi non può rilevarne l’effetto.
Un dato molto interessante è quello dell’andamento temporale di questo parametro a 15 giorni dalla semina del mais. Negli alveari di controllo vi è un recupero completo del numero di bottinatrici rispetto alla situazione prima della semina, quindi si può ipotizzare che, se un danno c’è stato, questo è risultato reversibile e le capacità di recupero dell’alveare hanno riportato il parametro ad una condizione di ‘normalità’. Negli alveari di esposizione invece l’andamento non è così chiaro in quanto si nota una certa tendenza al recupero che però è completa solo per uno dei due alveari (quello denominato E2 in Tabella 2) dove a 15 giorni dalla semina si ripristinano le condizioni di ‘normalità’, mentre per l’altro alveare alla stessa data si ha ancora un indice di bottinaggio alterato. Questa disparità determina una barra di variabilità molto ampia in Figura 3 per gli alveari di esposizione sia per il 3 che per il 9 luglio. Il numero delle bottinatrici sembra essere il parametro che più rappresenta gli eventuali effetti complessivi della semina in quanto è in grado di registrare sia quello che accade in prossimità dell’alveare, sia quello che succede al di fuori di esso.
Nel complesso, entrambi i parametri si dimostrano concordi nel mostrare un effetto significativo del giorno della semina sulla salute delle api. Anche la distanza degli alveari rispetto al campo in semina è un elemento che influisce sia sulla mortalità diretta nelle underbasket sia sul numero di bottinatrici in entrata nell’alveare.
Per quanto riguarda le analisi chimiche sui residui di thiamethoxam nella vegetazione e nel polline del mais trattato alla semina, nessun campione analizzato ha mostrato residui al di sopra del limite di rilevabilità analitica di 50 ng di thiamethoxam per g di peso fresco della matrice analizzata (vegetazione e polline).
 
 
 IMMAGINI ALLEGATE A QUESTO ARTICOLO: 9 tot.

Mais conciato

Dettaglio dell'etichetta della confezione di mais
Figura 1
Mappa dell’area di studio con evidenziata la superficie di semina del mais di secondo raccolto (a), la posizione degli alveari di esposizione (b) e quella degli alveari di controllo (c) entrambi rappresentati sulla mappa con circoli rossi ed infine il luogo di provenienza dei campioni di vegetazione indicato dai circoli verdi.
Figura 2
N° api morte/giorno nelle underbasket negli alveari di controllo ed in quelli di esposizione. Le barre indicano l’intervallo ± deviazione standard intorno alla media.
Figura 3
N° medio api bottinatrici/minuto negli apiari di controllo ed in quelli di esposizione. Le barre indicano l’intervallo ± deviazione standard intorno alla media.
Tabella 1
Numero di api morte rinvenute nelle underbasket. Il dato si riferisce alle api morte nelle 24 h precedenti le ore 16.00 del giorno indicato. Il giorno della semina è evidenziato in grassetto.
Tabella 2
Numero medio di bottinatrici con polline entranti nell’alveare nel tempo di un minuto. Il dato si riferisce alla media di tre rilievi eseguiti per ogni alveare a distanza ravvicinata intorno alle ore 11.00 del giorno indicato. Il giorno della semina è evidenziato in grassetto.

Underbasket

Conta visiva del rientro delle api bottinatrici
 
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Scritto in data 01/07/2010 da Mario Colombo*, Marta Mazzoleni** e Paolo Tremolada**, Francesco Saliu*** e Marco Vighi***
*Dipartimento di Protezione dei Sistemi Agroalimentare e Urbano e Valorizzazione della Biodiversità, Università degli Studi di Milano, Via Celoria 26, 20133 Milano **Dipartimento di Biologia “Luigi Gorini” Università degli Studi di Milano, Via Celoria 26, 20133 Milano ***Dipartimento di Scienze dell’Ambiente e del Territorio, Università di Milano-Bicocca, Piazza della Scienza 1, 20126 Milano
 
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